Auto-NGS 200是一款高通量、功能豐富、配置靈活的桌面型多功能自動化移液工作站。該工作站由熒光計、機械工作臂、溫度控制、PCR儀等功能模塊及一臺計算機構(gòu)成，可通過編寫程序控制工作站運行，模擬人工操作流程進行文庫構(gòu)建。該工作站每批次可構(gòu)建96個文庫。除實驗過程中涉及的試劑配制需要人工進行以外，其余步驟均可在Auto- NGS 200中自動完成。

● Auto-NGS 200基因測序文庫制備工作站

● A公司tNGS試劑

● Qubit1X dsDNA HS Assay Kit試劑

● 主要耗材

96孔PCR 板、PCR 密封蓋、96方孔圓底1.0mL 板、200μL自動化吸頭、96道儲液槽、八連PCR管(0.2mL)、100mL儲液槽、96孔儲液槽等。

a. 線性測試：單一靶標(甲流培養(yǎng)物)核酸提取后稀釋10倍(高濃度)；稀釋100倍 (中濃度)；1000倍(低濃度)測試病原檢出數(shù)。手工，自動化同步測試，對比兩種方法的檢出差異。

b.檢出限測試：以試劑盒檢出限為參照，對低濃度樣本進行文庫構(gòu)建后上機測序。

c. 污染測試：將樣本和NTC以梅花樁模式在耗材中排版，通過測序結(jié)果判定實驗污染情況。

將甲流培養(yǎng)物核酸提取后稀釋10倍（高濃度）；稀釋100倍（中濃度）；1000倍（低濃度），按照圖3的形式將不同濃度的核酸轉(zhuǎn)移到PCR板中。手工文庫構(gòu)建同理，對比檢出差異。

根據(jù)試劑盒說明書建立工作站運行程序，文庫產(chǎn)出后在Auto-NGS 200內(nèi)置熒光計檢測濃度，如圖2所示，NGS-200文庫濃度略高于手工建庫，自動化建庫的CV(變異系數(shù))與手工建庫無顯著差異(P<0.05)。

圖 2 文庫濃度

將文庫產(chǎn)物隨機選取4個樣本在Agilent 4150 TapeStation系統(tǒng)進行文庫片段分析，并與人工建庫產(chǎn)物進行對比。片段結(jié)果如圖3所示，片段長度和平均片段大小均與人工建庫結(jié)果相似。

圖 3 文庫片段長度

構(gòu)建成功的文庫在Auto-NGS 200中，以96混1的方式進行Pooling，每個樣本質(zhì)量為60ng進行均一化處理后做測序前準備。在MiniSeq System平臺進行測序，測序結(jié)果如圖4所示。

圖 4 Auto-NGS 200 建庫和手工建庫歸一化reads 數(shù)分布圖

如表2，實驗方案：選擇DNA 病毒，RNA 病毒，細菌，真菌各兩種，共8例樣本；將同一樣本同一濃度的核酸混為一管；根據(jù)核酸量分裝，每孔14μL。使用手動-自動化建庫對檢測限核酸進行建庫，比較兩種方法的檢出差異。

按照表2的形式將DNA 病毒1(4000)、RNA 病毒1(1000)、DNA 病毒2 (2000)、RNA 病毒2(500)、真菌1(10000)、細菌1(10000)、真菌2(10000)、細菌2(15000)培養(yǎng)物的核酸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PCR 板中。手工文庫構(gòu)建同理，對比測序結(jié)果能否檢出。

表 2 Auto-NGS 200 文庫構(gòu)建核酸排版

文庫濃度檢測方法同3.1.1，如圖5所示，Auto-NGS 200文庫濃度略高于手工建庫。

如表3所示，自動化建庫與手工建庫檢出結(jié)果。

如圖6所示，將樣本和NTC以梅花樁形式在96孔PCR板中排版，通過NTC的歸一化reads值判定實驗污染情況。手工和儀器同步。

圖 6 污染情況

根據(jù)線性測試測序數(shù)據(jù)來看，最終的歸一化reads值對應(yīng)樣本濃度的梯度。Auto-NGS 200 文庫濃度略高于手工建庫，自動化建庫的CV (變異系數(shù))與手工建庫無顯著差異。Auto-NGS 200 的甲流歸一化reads 值約為手工建庫的80~85%;儀器建庫濃度較手工濃度略高，尤其是稀釋梯度為10時較明顯；手工建庫重復(fù)性不如儀器建庫，變異系數(shù)(CV) 較大。

根據(jù)上機信息表給出的培養(yǎng)物種類，認為歸一化reads值≥20即為檢出，結(jié)果如表1所示。DNA 病毒2自動建庫有漏檢，RNA 病毒2均有漏檢。其余病原檢出情況：本次實驗存在一定污染，樣本檢出不止有培養(yǎng)物目標病原，根據(jù)病原檢出頻譜分析，將部分頻譜一致的病原也納入統(tǒng)計，主要有鼻病毒、乙流、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群等污染。

自動化建庫的整體污染同手動建庫相差不大，自動化建庫主要是白念、洋蔥等病原污染，手動建庫主要是鼻病毒、非結(jié)核分枝桿菌等污染。從排版看手動NTC基本無甲流污染，自動NTC基本無甲流污染。

NTC檢出頻譜：鼻病毒、大腸埃希菌、白念珠菌檢出頻次最高，且在排版上分布較廣，懷疑可能實驗室環(huán)境有這幾種病原污染；手動建庫鼻病毒、流感嗜血桿菌、具核梭桿菌污染明顯升高。